Existen diversas herramientas analíticas para la detección y cuantificación de alérgenos, ya sea en superficies, aguas de lavado, materias primas y en producto terminado. Estas son utilizadas por el sector productivo y laboratorios de análisis de alimentos en el área de servicios e investigación.

Las metodologías de análisis de alérgenos permiten detectar tanto ADN como las proteínas asociadas al alérgeno, desde el punto de vista cuantitativo y cualitativo.

La selección de la técnica a utilizar va a depender del objetivo que se quiera cumplir como la validación de protocolos de limpieza, la verificación de puntos de control o la determinación del alérgeno en materias primas o productos terminado para un mejor etiquetado o para la obtención de una certificación.

A continuación, se describirán las tecnologías para el análisis de alérgenos más aplicadas a nivel comercial.

En el cuadro 1 (http://163.178.170.199/Figuras_cuadros.pdf), se encuentra un resumen de las distintas técnicas aquí mencionadas y sus límites de detección y de cuantificación.

Método colorimétrico (hisopos): es un método cualitativo que se basa en una reacción química entre los residuos de proteína presentes en la muestra y un reactivo que al contacto con la misma genera un color. Dicha técnica se utiliza exclusivamente para la determinación de la presencia o ausencia del alérgeno en superficies luego de un protocolo de limpieza. Para realizar la prueba se toma una muestra de la superficie con el hisopo y se observa el cambio de color si se encuentra cualquier residuo de proteína. Las ventajas que presenta son la accesibilidad, rapidez y bajo costo.

Análisis mediante flujo lateral: esta es una metodología que se basa en una reacción bioquímica entre un antígeno, presente en la muestra, con el anticuerpo que se encuentra adherido en la superficie de una tira, la cual corresponde en la mayoría de los casos a un material poroso. Los anticuerpos son proteínas producidas en células especializadas del sistema inmune y son un mecanismo de defensa contra estructuras que se reconocen como extrañas al cuerpo (antígenos). Los anticuerpos se unen a sus antígenos mediante un patrón de interacciones selectivas y altamente específicas, similar a una cerradura y una llave.

Para efectuar la prueba de flujo lateral se sumerge la tira en la muestra líquida y si el analito (alérgeno) está presente, se observa una línea de color, adicional al control, después de varios minutos. Si la prueba es negativa, la tira queda solamente con la línea control. En el caso de que la muestra sea líquida (agua de lavado, por ejemplo) la prueba de flujo lateral se ejecuta sin la extracción de alérgeno. Cuando se realiza el análisis en superficies, se toma una muestra con un hisopo húmedo que luego se sumerge en la solución extractora y se realiza la prueba.  En muestras de materia prima y producto terminado, es necesaria una extracción del alérgeno siguiendo la metodología que se establece en el protocolo de los kits de análisis para luego hacer la prueba (Fig. 1 http://163.178.170.199/Figuras_cuadros.pdf)

Los resultados obtenidos son de carácter cualitativo, por lo que solamente se utilizan para determinar la ausencia o presencia del alérgeno en superficies, extractos de materias primas y producto terminado. Entre las ventajas se encuentran: 1) se obtienen los resultados en un tiempo corto y confiable 2) la técnica es de fácil manejo 3) los costos son bajos y 4) los límites de detección se encuentran a partir de 1 mg/kg.

Análisis por técnica ELISA: el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA, por sus siglas en inglés) se basa en la reacción antígeno-anticuerpos. Se han establecido muchos formatos de pruebas cualitativas o cuantitativas para esta metodología. La prueba ELISA implica al menos un anticuerpo específico para un antígeno particular. Un principio fundamental es que uno de estos componentes inmunológicos está inmovilizado en una fase sólida. En el principio básico, el analito (alérgeno) de la muestra interactúa con un anticuerpo; esta interacción puede visualizarse mediante un cambio colorimétrico mediado por enzimas, que se cuantifica mediante un espectrofotómetro.

Existen dos principios en la prueba ELISA: sándwich y competitivo en los cuales se puede encontrar diferentes tipos de anticuerpos y la aplicación de cada uno dependerá del tipo de matriz, el proceso y el alérgeno a determinar. Existen kits comerciales para el análisis de alérgenos por ELISA. La veracidad de estos métodos es muy alta cuando se analizan materias primas y productos ligeramente procesados. Sin embargo, pueden producirse problemas en muestras de productos altamente procesados, al ser más difícil extraer la proteína alergénica. Algunos alimentos, tales como aquellos que están expuestos a tratamientos térmicos altos o los que contienen huevo y/o leche por lo general son difíciles de trabajar en el laboratorio.

Análisis enzimáticos: el formato de prueba se basa en una reacción enzimática que produce un cambio de color. Usando un instrumento apropiado, este cambio de color se puede medir fácilmente. Las pruebas enzimáticas se realizan en una variedad de segmentos de alimentos y piensos, incluidas bebidas alcohólicas (cerveza, vino, bebidas alcohólicas), piensos, alimentos para bebés, productos de panadería, confitería, productos lácteos, alimentos dietéticos, zumos de frutas, miel, productos cárnicos, productos farmacéuticos, alimentos preparados, aceite, mariscos, refrescos, especias, vinagre y agua. Es un método cuantitativo que requiere aproximadamente 15 min.

 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés): la detección de alérgenos asociados al ADN se realiza mediante el PCR, ya sea PCR punto final o PCR en tiempo real (qPCR). El PCR punto final es una tecnología que emplea una enzima específica, la Taq ADN Polimerasa, que permite copiar de manera exponencial una secuencia de ADN blanco (Fig. 2, http://163.178.170.199/Figuras_cuadros.pdf) En este caso sería el ADN que se pueda extraer de la matriz alimentaria y se utiliza también un par de iniciadores o cebadores que se unen a la región del ADN que se quisiera estudiar o detectar.

La aplicación de la técnica de PCR ha sido fundamental en la detección y cuantificación de alérgenos, con aplicaciones en el análisis de muchas especies y tipos de matrices, aunque es posible citar algunas limitaciones entre las que se encuentran:

  1. Las altas temperaturas de almacenamiento de un alimento durante un largo período podrían inducir una cierta degradación del ADN, afectando así negativamente al rendimiento de los métodos de PCR relativos a la detección de genes que codifican para ingredientes alergénicos.
  2. En algunos ensayos de PCR la sensibilidad absoluta es expresada como estimación de fragmentos de ADN (pg, pg/lL o número de copias), y esto es un parámetro muy limitado. En otras ocasiones se convierte la cantidad absoluta de ADN en la cantidad relativa correspondiente del ingrediente alergénico, aunque esto no tiene en cuenta el efecto de la matriz alimenticia.
  3. En ambientes ácidos (aderezos de ensalada y mezclas de tomate y cítricos), se podría degradar el ADN, por ende, no se podría realizar la detección. Es importante aclarar que a pesar de que se puede cuantificar el ADN, no es posible correlacionar ese valor con la cantidad de proteína (que a fin de cuentas es la sustancia alergénica).

En conclusión, existen distintas técnicas que pueden ser empleadas para la detección de alérgenos. La gran mayoría están disponibles en el país, pues se tienen los proveedores, laboratorios y personal capacitado. La veracidad de estos métodos es muy alta cuando se analizan materias primas y productos ligeramente procesados. Sin embargo, pueden producirse problemas en muestras de productos altamente procesados, esto por cuanto, la industria de alimentos emplea una variedad de metodologías de procesamiento de alimentos (tratamiento térmico, uso de enzimas, alta presiones, acidulantes, entre otros) que pueden modificar, desnaturalizar y degradar las proteínas alimentarias. Estas modificaciones en la estructura de la proteína y los efectos de la matriz podrían interferir con la extracción de proteínas y generar falsos negativos en algunas de las pruebas.  Por lo que es muy importante que se realice una buena selección y aplicación del método que se va a emplear, según el tipo de matriz y objetivo a alcanzar.

Artículo elaborado por:

Carolina Cortes1, Mildred García2, Gabriela Ortiz2, Javier Herrera3, Luis Quesada4, Mauricio Redondo5, Natalia Barboza1,6, Rebeca López1

1Centro Nacional en Ciencia y Tecnología de Alimentos (CITA), Universidad de Costa Rica (UCR), 2SCANCO, Costa Rica, 3AGQ Labs, 43M Costa Rica, 5Facultad de Microbiología, UCR, 6Escuela de Tecnología de Alimentos, UCR.